Hatalmas (de tényleg hatalmas) siker a technika, amely a sejteket óriási méretűre növeli a legapróbb részletek feltárása érdekében. A szakértők egy olyan polimert használnak, amely hasonló a pelenkákban alkalmazott szuperabszorbens anyagokhoz, és ezzel növelik a biológiai minták térfogatát az eredeti egymilliárdszorosára – minden dimenzióban 1000-szeresére. Ezzel a mértékű „felpumpálással” egyetlen sejtet egy egéragy méretére, egy fillérnyi méretű mintát pedig egy olimpiai úszómedencényire lehetne növelni.
A szakértők a technikát használva hagyományos fénymikroszkópok segítségével térképezhetik fel az aminosavak (a fehérjék építőelemei) elhelyezkedését a fehérjékben és a peptideknek nevezett apró molekulákban. A módszert egy, a hónap elején a bioRxiv oldalon közzétett preprint cikkben ismertették. Korábban a molekulák ilyen részletes megfigyelését általában drága és bonyolult technikákkal, például kriogenikus elektronmikroszkópiával (cryo-EM) és röntgenkrisztallográfiával valósították meg.
„Ez a strukturális biológia demokratizálódása”
– mondja a tanulmány társszerzője, Silvio Rizzoli, a Göttingeni Egyetemi Orvostudományi Központjának (UMG) idegkutatója és képalkotási szakértője. „Ez valóban a fehérje lényegének alapvető leírását teszi lehetővé” – teszi hozzá az egyik társszerző, Helena Hu, a Massachusetts Institute of Technology (MIT) biomérnöke.
Expanziós mikroszkópia
A fizika törvényei korlátozzák a fénymikroszkópok optikai felbontását: a körülbelül 200 nanométernél kisebb távolságra lévő objektumok nem különböztethetők meg egymástól. A „szuperfelbontású” fénymikroszkópos technikák – amelyek általában optikai trükkökre és drága berendezésekre támaszkodnak – 10 nm alá csökkentették ezt a felbontási határt.
2015-ben Edward Boyden, az MIT neuromérnöke, a tanulmány társszerzője és kollégái kifejlesztettek egy alternatív módszert, amellyel rendkívül nagy felbontás érhető el hagyományos fluoreszcens fénymikroszkópok segítségével. A kutatók egy duzzadó hidrogél segítségével minden irányban körülbelül négyszeresére növelték a szövetminták térfogatát. Ezáltal a sejtkomponensek egymástól távolabb kerültek, javítva a felbontást.
Azóta a kutatók Boyden „expanziós mikroszkópia” nevű módszerét folyamatosan fejlesztették azáltal, hogy a mintákat egyre nagyobb térfogatra duzzasztották, de a tágulás általában körülbelül 20-szoros méretnövekedésig tűnt megvalósíthatónak. Az ennél is nagyobb méret elérése érdekében a kutatók kifejlesztettek egy új hidrogélreceptet, amelynek segítségével a mintákat még inkább kiterjesztették. A csapat emellett egy ONE mikroszkópia nevű expanziós mikroszkópos módszert is alkalmazott a fehérjeszerkezetek fénymikroszkópos feltérképezésére.
A tisztított fehérjéket a hidrogélhez kötötték, majd enzimekkel vagy hővel szétbontották, így ezeket a térszerkezet megőrzése mellett lehetett tágítani.
Óriási fehérjék
Az így megvalósított, 1000-szeres tágítás során a kutatók megjelöltek az mCLING nevű peptidet alkotó kilenc aminosav közül többet is. Ezután fluoreszcens mikroszkóppal leképezték az építőelemek egymáshoz viszonyított elhelyezkedését. A mérések pedig összhangban álltak a számítógépes szimulációkból származó mCLING-szerkezetekkel.
A módszer feltárta egy nanotestnek (az antitest kicsinyített változata) nevezett fehérje szerkezetét is, valamint egyes aminosavainak elhelyezkedését. Ezenkívül a kutatók a technikát felhasználva feltérképezték a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) korábban meghatározott szerkezetét is, amely a biotechnológiában más fehérjék jelölésére használt egyik alapvető eszköz.
A kutatók becslése szerint a GFP-ről – több ezer pillanatfelvételből rekonstruált – modelljük körülbelül 1,2 nm, azaz 12 ångström felbontást valósít meg. Ez elmarad a nyilvános adattárakban elérhető, röntgenkrisztallográfiával meghatározott 1,9 ångströmös GFP-szerkezettől, illetve attól a részletességi szinttől, amelyet a szakértők kriogenikus elektronmikroszkópos vizsgálatokkal rendszeresen elérnek.
Ahogy azonban Ali Shaib, az UMG nanoszkóp-szakértője és a tanulmány társszerzője elmondja, hogy módszertani fejlesztéseknek köszönhetően egy még nem publikált kísérletben a tisztított fehérjék felbontását 10 ångström alá sikerült csökkenteni. Rizzoli megjegyzi, hogy a csapat jelenleg már képes körülbelül 10 ångström felbontással meghatározni azoknak a fehérjéknek az alakját is, amelyek még a sejtek belsejében vannak.
„Arra törekszünk, hogy megfizethető optikai mikroszkópok segítségével kriogenikus elektronmikroszkópokhoz hasonló felvételeket hozzunk létre”
– mondja Shaib.
Rizzoli ugyanakkor hangsúlyozza, hogy az olyan technikákat, mint az 1000-szeres nagyítású mikroszkópia, annak alapján kell megítélni, hogy milyen biológiai információkat tudnak feltárni. „Nem hiszem, hogy csak a felbontás a lényeg, hanem az, hogy mit lehet vele látni.”
Olcsóbb mikroszkópia?
A korábbi szuperfelbontású fénymikroszkópos technikák ångström-szintű felbontást tettek lehetővé, mondja Lothar Schermelleh, az Oxfordi Egyetem képalkotási szakértője, de a szerkezeti információ, amelyet ezek a módszerek nyújtanak, korlátozott. „Ez a kutatás mindent megváltoztat. A GFP megfigyelése egyszerűen fantasztikus” – mondja a szakértő.
Kirti Prakash, a Ruskin Egyetem komputációs biológusa ugyanakkor szkeptikus azzal kapcsolatban, hogy az egyes dimenziókban 1000-szeresre nagyított minták tényleg megőrzik eredeti jellemzőiket, és úgy véli, hogy a tanulmányban közölt szerkezeti részleteket más módszerekkel is validálni kellene. „Ez nagyon menő, izgalmas eredmény. De személy szerint úgy gondolom, hogy nem tártak fel új biológiai tényeket” – mondja.
A biológiai minták egymilliárdszoros nagyítása egyértelmű kihívásokat jelent. Ilyen méreteknél még a közepes méretű fehérjék is kitölthetik a mikroszkóp teljes látómezejét, mondja John Danial, a St Andrews Egyetem kísérleti fotonikai kutatója. A nagy felbontású struktúrák miatt számos részecskét kell „átlagolni”, így a kutatóknak nagy mennyiségű képet kell gyűjteniük egy egyetlen fehérjeszerkezet rekonstruálásához, magyarázza a szakértő.
Hu elmondása szerint a technika automatizált képalkotással együtt is alkalmazható: úgy tűnik, hogy a gélek napokig megőrzik a méretüket anélkül, hogy összezsugorodnának. A technikával ráadásul olyan fehérjéket is le lehet képezni, amelyek túl kicsik a kriogenikus elektronmikroszkópos vizsgálathoz, teszi hozzá.
Danial mindezzel együtt is reméli, hogy az olyan fénymikroszkópos technikák, mint az 1000-szeres nagyítás, új szerkezeti betekintést kínálnak a fehérjékbe és más biomolekulákba, és úgy véli, hogy ezek a módszerek csökkenthetik a strukturális biológia gazdasági korlátait. Afrikában például csupán egyetlen kriogenikus elektronmikroszkópos létesítmény működik. Ahogy a kutató mondja:
„Egy öt-tízezer dolláros mikroszkóppal szerkezeti szinten lehetne képet készíteni a fehérjékről. Ilyen a mikroszkópok pedig ott is rendelkezésre állnak, ahol a kriogenikus elektronmikroszkópok nem elérhetők.”
