A CRISPR génszerkesztő módszer berobbanása óta eltelt évek során a biztató eredmények mellett kirajzolódtak az eljárás korlátai is: a klasszikus CRISPR-gépezet túl nagy és nehézkes ahhoz, hogy a szervezet egyes szöveteibe bejusson, és elvégezze a DNS szeletelését és a problémás szakaszok lecserélését. Nemrégiben azonban a 2020-ban Nobel díjat kapott Jennifer Doudna és kollégái arról számoltak be, hogy reményeik szerint jelentős előrelépés tettek az eljárás egy új, szélesebb körben alkalmazható változatának kifejlesztése felé. Az általuk leírt egy „mini CRISPR” révén sikeresen kezelték egerek és majmok izomsejtjeit, hatékonyan szerkesztve egy neuromuszkuláris rendellenességekben szerepet játszó gént.
A CRISPR módszere egy eredetileg baktériumokban kifejlődött molekuláris ollón alapul, amely a mikrobák immunrendszerének része. Ez célzott pontokon képes átvágni a DNS-t, lehetővé téve, hogy kivágják a gén egy problémás részét, és azt esetleg egy másik szakasszal helyettesítsék is. Az amerikai hatóságok 2023 decemberében hagyták jóvá az első CRISPR-alapú terápiát, a sarlósejtes vérszegénység kezelésére. Ez a kezelés a beteg véréből őssejtek kivonását és a CRISPR segítségével történő javítását foglalja magában, mielőtt visszajuttatnák azokat a szervezetbe.
Jelenleg is folynak klinikai kísérletek olyan kezelésekkel kapcsolatban, amelyek keretében a CRISPR-szerkesztőt közvetlenül a véráramba juttatják, és így például ígéretesen kezelték már májsejtek génjeit. De ez a megközelítés, amely során a CRISPR-komplexet zsírcseppekbe csomagolják, más szöveteknél problémásnak tűnik. A kutatók így inkább azzal próbálkoznak, hogy a CRISPR-t kódoló DNS-t alaposan tanulmányozott adeno-asszociált vírusok, vagyis AAV-k segítségével juttassák be. Ennek megvalósítása azonban szintén kihívást jelent, részben azért, mert a CRISPR összetevői elég méretesek, különösen a DNS-t vágó Cas9 enzim, amely több mint 1300 aminosavat tartalmaz. Ez túl nagy ahhoz, hogy egyetlen AAV-ba belezsúfolják, ezért a kutatók inkább két vagy több AAV segítségével próbálták meg a CRISPR-t és a hozzá tartozó vezető RNS-t bejuttatni. Ez azonban eddig nem működött túl jól.
Több kutatócsoport dolgozik azon, hogy olyan miniatürizált CRISPR-rendszereket hozzon létre, amelyek továbbra is hatékonyak a szerkesztésben, de egyetlen AAV-vektorba csomagolhatók. Közöttük van a Mammoth Biosciences csapata is, amely végre talán sikerrel járt. Kutatóik a mikrobákban felbukkanó sokféle CRISPR-változat genetikai szekvenciaadatainak átvizsgálásával kezdték a munkát. A kezdeti 176 jelöltet egy sor tesztnek vetették alá, és megtalálták „a tűt a szénakazalban”, mondja Lucas Harrington, a vállalat tudományos vezetője és társalapítója, Doudna egykori tanítványa. A legjobbnak tűnő jelöltnek a NanoCas nevet adták: ez 425 aminosavból áll, ami a Cas9 hosszának körülbelül egyharmada. Harrington és kollégái ráadásul tovább is módosítottak rajta, hogy még kisebb legyen, de hatékonyan tudja vágni az emlősök DNS-ét.
Ez a „karcsúsítás” lehetővé tette, hogy a szerkesztő komplex DNS-e elférjen egyetlen AAV-vektorban. A csoport megmutatta, hogy a NanoCas laboratóriumban különböző emlőssejtekben képes DNS-t szerkeszteni, majd egerekbe is beültették. Amikor a PCSK9 nevű koleszteringén kikapcsolására használták a májban, a NanoCas a sejtek mintegy 60%-át sikeresen szerkesztette, ami legalább olyan jó teljesítmény, mint amit Cas9 nyújtani tud.
Ezután a hagyományos CRISPR számára jóval nehezebb célpont felé fordultak: az izmokhoz. Azt tesztelték, hogy a NanoCas képes-e megcélozni az izomsejtekben a disztrofin nevű gént, amely egy kulcsfontosságú szerkezeti fehérjét kódol. A Duchenne-izomdisztrófiában, egy súlyos izomsorvadásos betegségben szenvedőknél ennek a fehérjének a génje tartalmaz mutációt, így a szervezet vagy egyáltalán nem képes ilyen fehérjét előállítani, vagy nem eleget a normális működéshez.
A mutáns disztrofin gén humán változatával rendelkező egerekben a NanoCas jól működött, a sejtek 10-40%-át szerkesztette sikerrel különböző izomtípusokban, beleértve a szívizmot és vádlit is. (Ezek a módosított egerek nem betegednek meg, mint a mutációval rendelkező emberek, így a kutatócsoport a Duchenne-tünetekre gyakorolt lehetséges hatásokat nem tudta felmérni.)
Végül három egészséges makákón is végeztek egy kísérletet. A kutatók a komplexet hordozó AAV-t az állatok véráramába fecskendeztek. Ellenőrizték a májfunkciókat, mivel az AAV-terápia szövődménye lehet májkárosodás, de minden mérőszám a normális tartományban maradt. És ami még fontosabb, izomtípustól függően a NanoCas a majmok vázizomsejtjeinek akár 30%-ában is szerkesztette a disztrofin génjét. A szívizomban ez a szám valamivel alacsonyabb volt, körülbelül 15%.
Ezek a szintek már bőven abban a tartományban vannak, amit klinikailag hasznosnak tekinthetünk, mondja Terence Flotte, génterapeuta, a Massachusettsi Egyetem T.H. Chan Orvosi Karának dékánja. Ugyanakkor ő és mások is megjegyzik, hogy a kezelés fejlesztése még korai időszakában jár, még nincs információ arról sem, hogy a stratégia segíthet-e egy beteg állat gyógyulásában. Az AAV alkalmazása kockázatokkal is jár, beleértve az immunreakciókat és a lehetséges célponton túli hatásokat, amikor az egészséges DNS-t is érinthetik. „Az előzetes adatok biztatóak, de korlátozottak” – mondja Mark Kay, a Stanford génterapeutája. De ígéretes, hogy ez a miniatűr CRISPR milyen könnyen becsomagolható egyetlen AAV-vektorba, ami új szöveti célpontok egész sorát nyitja meg.
Harrington is elismeri a kihívásokat, beleértve az AAV-kkal kapcsolatos aggályokat, de bizakodó a jövővel kapcsolatban. „Máris nagyon hatékonyan tudunk szerkeszteni egyetlen AAV-val is” – mondja. A kutató elmondása szerint a Mammoth folytatja a Duchenne-rendellenességgel kapcsolatos munkát, és a NanoCas-rendszert más izombetegségeken, valamint az agyi betegségek szempontjából fontos célpontokon is tesztelni kezdi. „Abban próbálunk gondolkodni, hogy mit valósíthatunk meg a lehető leggyorsabban” – mondja.
