Mindez azért is érdekes, mert a két kutatónak esze ágában sem megreformálni a génmérnöki módszereket, kutatásaiknak kezdetben egészen más volt a célja. Emmanuelle Charpentier 2002-ben a Bécsi Egyetemen kezdett saját kutatócsoportjával annak felderítésén dolgozni, hogy miért olyan agresszív és ellenálló a Streptococcus pyogenes nevű patogén, amelyet riasztó hatásai miatt húsevő baktériumnak is neveznek. A mikroba viselkedésének megértése érdekében a szakértők annak génszabályozási rendszerét kezdték tanulmányozni.
Jennifer Doudna 2006-ban a Berkeleyn munkálkodott saját csapatával, aktuálisan arra fókuszálva, hogyan szabályozzák az általuk újonnan felfedezett, apró RNS-molekulák a sejtekben a génaktivitást (amit RNS-interferenciának neveznek), amikor érdekes hívást kapott egyik kollégájától. A mikrobiológus munkatárs egy új felfedezéssel kereste meg Doudnát: elmesélte neki, hogy a baktériumok és archeák genomjában egy érdekes sajátosságot detektáltak a szakértők.
Olyan rövid, ismétlődő DNS-szekvenciákról van szó, amelyeket egyedi szekvenciák előznek meg, mintha egy könyvben azonos tagmondatok ismétlődnének, de mindegyiket egy másfajta, egyedi tagmondat előzne meg.
A jelenség a CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, azaz „halmozottan előforduló, szabályos közökkel elválasztott palindromikus ismétlődések”) nevet kapta, és legfőbb érdekességének az bizonyult, hogy az ismétlődő részeket megelőző, egyedi szekvenciák különböző vírusok genetikai kódjával mutattak egyezést. Erre alapozva a szakértők úgy sejtették, hogy a genom ezen részei egy ősi immunrendszer alapjait jelentik: ezekben tárolja a mikroba azon kórokozók jellegzetes darabkáit, amelyekkel korábban találkozott, hogy így könnyen felismerhesse a patogént, ha ismét összefut azzal. Az ominózus telefonhívás idején még senki sem tudta, hogy ez pontosan hogyan működhet, de a kutatók azt gyanították, hogy a baktériumok RNS-interferencia útján számolnak le a vírusokkal, és „tárazzák be” azokat saját genomjukba.
Doudna rögtön beleásta magát a témába, és rövidesen azt is megtudta, hogy a jelenséget vizsgáló kutatók a szekvenciákkal összefüggésbe hozható, Cas-nak (CRISPR-associated) nevezett géneket is felfedeztek. Ezek pedig érdekes módon nagyon hasonlítanak azon fehérjék génjeire, amelyekről tudni lehet, hogy a DNS kicsomagolásában és átvágásában vesznek részt.
Rögtön felmerült tehát a gyanú, hogy talán a Cas-fehérjék is hasonló funkciót tölthetnek be, vagyis a vírus RNS-ét szabdalják fel.
Ezt a következő évek során Doudna sikeresen igazolta is, és több különböző Cas-fehérje funkcióját derítette fel, miközben más kutatócsoportok eltérő Cas-proteineket vizsgáltak. A kutatásokból kiderült, hogy a bakteriális immunrendszer többféle lehet: a Doudna által elsődlegesen vizsgált, összetett gépezet, amelyben nagyon sokféle Cas-fehérje dolgozik együtt (1.osztály), vagy egy jelentősen egyszerűbb rendszer, amely kevesebb fehérjével működik (2. osztály). Emmanuelle Charpentier egyike volt azoknak, akik az utóbbi rendszerek egyik példájába botlottak bele.
Egy bakteriális védekező mechanizmus
Charpentier, aki 2009-ben áttette a székhelyét a svédországi Umeå Egyetemre, eddigre részletesen feltérképezte az S. pyogenesben található apró RNS-molekulákat. Köztük talált egyet, amely korábban teljesen ismeretlen volt, viszont nagy mennyiségben volt jelen a baktériumban. Ráadásul a kérdéses RNS genetikai kódja kísértetiesen hasonlított a bakteriális genom CRISPR-szekvenciáira.
Az alaposabb elemzések nyomán aztán Charpentier igazolta, hogy a kérdéses RNS egyik része pontosan megegyezik a CRISPR ismétlődő szekvenciáival, vagyis azok tökéletesen összeillenek.
Kiderült, hogy a szakértő és kollégái véletlenül azonosítottak egy 2. osztályba tartozó CRISPR/Cas-rendszert, amely egyetlen fehérjével, a Cas9-cel működik.
A kutatók rövidesen azt is megmutatták, hogy a kérdéses RNS egy úgynevezett transzaktiváló CRISPR RNS (tracrRNS), amely a CRISPR-szekvenciáról képződő hosszabb RNS éréséhez szükséges, vagyis ahhoz, hogy ez aktívvá váljon.
Charpentier kutatócsoportja 2011-ben publikálta az új rendszerről és a tracrRNS-ekről szóló eredményeit, és mivel a kutatócsoport vezetője érezte, hogy a CRISPR/Cas9-rendszer nagyon ígéretes lehet, elkezdett keresni egy, a témában jártas biokémikus partnert. Jennifer Doudna tökéletes választásnak tűnt, így amikor Charpentier-t ugyanezen év tavaszán meghívták, hogy egy nemzetközi konferencián számoljon be felfedezéseiről, azzal a céllal érkezett Puerto Ricóba, hogy az eseményen szintén résztvevő Doudnával is megismerkedjen.
Doudnát nem kellett sokat győzködni, hogy együttműködésbe kezdjenek a CRISPR/Cas9-rendszer működésének további felderítésében, és hamarosan megkezdődött a közös munka. A szakértők sejtették, hogy a CRISPR-RNS a vírus DNS-ének felismerésére szolgál, a Cas9 pedig a DNS-t vágja, az első laborkísérletek azonban nem igazolták ezt. Végül úgy sikerült működésre bírni a rendszert, hogy ahhoz hozzáadták a tracrRNS-eket is. Ezekről Charpentier azt hitte, hogy csak a CRISPR-RNS aktiváláshoz szükségesek, de kiderült, hogy a Cas9 működésének is előfeltételei:
amint hozzáadták ezeket a kísérlethez, a fehérje kettőbe vágta a vírus DNS-ét.
A genom svájci bicskája
A történet itt véget is érhetett volna, hiszen Charpentier és Doudna igazolták előzetes feltevésüket: felfedeztek és leírtak egy alapvető védekezési mechanizmust, amelyet a baktériumok alkalmaznak a vírusok ellen. A szakértők azonban úgy döntöttek, hogy megpróbálják hasznosítani a felfedezést. Ehhez egyszerűsítettek a genetikai ollón: a tracrRNS-et és a CRISPR-RNS-t egyetlen molekulává kapcsolták össze, amit irányító RNS-nek (guide RNS, sgRNS) neveztek.
Majd belevágtak a történelmi kísérletbe: az egyszerűsített genetikai ollóval megkísérelték a DNS-t az általuk kiválasztott helyeken, célzottan átvágni. A kísérlet során egy gén öt helyét célozták meg a vágásra, majd az ollók CRISPR-szakaszait úgy alakították ki, hogy az megfeleljen a kívánt vágást határoló genetikai kódnak.
Az eredmény lenyűgöző volt: a gént pontosan azokon a helyeken szabdalta fel a Cas9-enzim, ahol a kutatók akarták.
Charpentier és Doudna 2012-ben tették közzé eredményeiket. A következő időszakban több kutatócsoport is demonstrálta, hogy a CRISPR/Cas9-rendszerrel egerek és emberek sejtjeinek genomja is módosítható, ami óriási lökést adott a génszerkesztésnek. A korábban a gének módosításához szükséges módszerek sokkal lassabbak, drágábbak és nehézkesebbek voltak, egyes változtatásokat pedig egyszerűen nem lehetett ezekkel kivitelezni.
A genetikai ollók révén azonban elméletben lehetségessé vált, hogy genomba ott vágjanak bele a kutatók, ahol akarnak, és hogy a kivágott rész helyére, a DNS saját javító mechanizmusait kihasználva, a CRISPR/Cas9-rendszer részeként bejuttatott új szekvenciát illesszék be.
Óriási lehetőségek
Mivel egy rendkívül egyszerűen használható génszerkesztési módszerről van szó, az mostanra széles körben elterjedt az alapkutatásban. A metódussal könnyedén átírható a sejtek vagy laborbeli állatok DNS-e, ami kulcsfontosságú az egyes gének funkcióinak felderítéséhez, és ahhoz, hogy ezek hogyan működnek egészséges állapotban, illetve bizonyos betegségek esetén.
A genetikai olló hasznosságát a növénytermesztők is gyorsan felismerték, hiszen az a korábbinál sokkal pontosabb és egyszerűbb módosításokat tett lehetővé a genomban. A CRISPR/Cas9-rendszerrel eddig többek közt a talajból a nehézfémeket nem felvevő, alacsony kadmium- és arzéntartalmú rizsfajtákat, szárazságtűrő gabonanövényeket, és a kártevőkkel szemben vegyi védekezés nélkül is ellenálló fajtákat hoztak létre.
A módszer az orvostudományban is nagy reményeket keltett, hiszen lehetőséget kínál az öröklött betegségek gyógyítására.
Már jelenleg is zajlanak klinikai vizsgálatok, amelyek során a CRISPR/Cas9-et a sarlósejtes vérszegénység, a béta-talasszémia vagy egyes szemproblémák gyógyítására használják.
A technika ezen felül új immunterápiák kidolgozásához is vezetett, például a rák kapcsán, és rövidesen talán egész szervek, például az agy vagy az izmok génjeinek kijavítására is alkalmazható lehet, olyan, korábban gyógyíthatatlan betegségeket téve gyógyíthatóvá, mint az izomsorvadásos kórképek vagy a Huntington-kór.
A génszerkesztés egyszerűsödésével és elterjedésével persze az ilyen módszerek kapcsán felmerülő etikai és szabályozási kérdések is egyre inkább központi problémává válnak, elvégre, a technikával akár nem terápiás céllal génmódosított embriókat is létre lehet hozni. Ezekkel a témákkal mindenképpen foglalkozni kell, mindez azonban nem változtat azon a tényen, hogy Charpentier és Doudna munkája alapjaiban formálta át az élettudományokat. Felfedezésük máris mindannyiunkra hatással van, óriási potenciált rejt, és a következő években minden bizonnyal újabb, áttörő felfedezésekhez vezet majd.
